Administration de médicaments neurothérapeutiques à l’aide d’une pompe osmotique dans un modèle de souris démyélinisées

Résumé

Source : Wang, X. et. al., Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo montre la méthode d’administration de médicaments neurothérapeutiques à l’aide d’une pompe osmotique dans un modèle de souris démyélinisées. La libération contrôlée du médicament favorise la remyélinisation en activant les cellules productrices de myéline dans le corps calleux.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Mise en place du modèle murin de démyélinisation induite par la lysolécithine

1. Préparez une solution de lysolécithine à 1 % (également appelée L-α-Lysophosphatidylcholine) avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
2. Stérilisez les ciseaux, les pinces, les hémostatiques incurvés et autres instruments chirurgicaux par stérilisation en autoclave. Stérilisez la zone chirurgicale et déposez des feuilles stériles. Tous les matériaux et réactifs utilisés pour la chirurgie doivent être préparés de manière aseptique. Il est important de garder la zone chirurgicale stérile tout au long de la procédure.
3. Anesthésier une souris C57BL6 postnatale comme suit.
   1. Place la souris dans la chambre d’isoflurane de l’appareil d’anesthésie pour petits animaux. Ajustez le débit d’O₂ à 300-500 mL/min et l’isoflurane à 3 %-4 %. Après une anesthésie suffisante, lorsque la souris devient immobile avec une respiration lente et stable, transférez la souris dans l’appareil stéréotaxique avec un coussin chauffant.
   2. Basculez la sortie de gaz de la chambre au masque d’anesthésie et ajustez l’isoflurane à 1 % à 1,5 % pour maintenir la souris dans l’état d’anesthésie. Attendez que la souris soit complètement anesthésiée, puis injectez du kétoprofène (3 à 5 mg/kg) par voie intrapéritonéale pour soulager la douleur. Avant l’opération, pincez les orteils de la souris et vérifiez sa réaction pour confirmer que l’anesthésie a réussi.
   3. Lorsque la souris est anesthésiée, elle ne peut pas réguler sa température corporelle. Par conséquent, surveillez et régulez la température corporelle de la souris pendant l’opération. Couvrez la surface des globes oculaires de la souris avec une pommade oculaire à l’érythromycine pour garder les globes oculaires humides sous anesthésie.
4. Fixez la tête de la souris dans l’appareil stéréotaxique avec la barre de dent et les barres d’oreille. (Figure 1A).
5. Utilisez un rasoir pour épiler les poils du haut de la tête. Assainissez la peau de la tête avec trois cycles de bétadine et d’éthanol à 75 %. Pour des raisons éthiques, couvrez le corps de l’animal, à l’exception du site de la chirurgie. À l’aide d’un scalpel, faites une incision mi-sagittale de 1 cm de long de la peau de la base du cou jusqu’entre les yeux pour exposer le crâne (figure 1B).
6. Essuyez doucement la surface du crâne avec un coton-tige stérile contenant 30 % de peroxyde d’hydrogène pour visualiser les sutures crâniennes (Figure 1C). Ajustez la hauteur de la barre dentaire et des barres auriculaires pour placer le point lambda et le point bregma à la même hauteur (c’est-à-dire avec les mêmes coordonnées de l’axe z lorsque la pointe de l’aiguille touche les points), de sorte que la suture sagittale soit horizontale.
7. Placez délicatement l’extrémité de l’aiguille de la seringue d’un microlitre (10 μL, 33 G) au point de bregma et réinitialisez les coordonnées x, y et z à 0 (Figure 1D). Déplacez la seringue vers le site d’injection (x : 1,04 ; y : 1,0, c’est-à-dire 1,04 mm latéralement par rapport à la ligne médiane et 1,0 mm postérieurement au point d’injection) conformément à l’invite de l’affichage numérique (Figure 1E).
8. Percez lentement un petit trou de bavure dans le crâne au point d’injection sans pénétrer la dure-mère avec une aiguille de seringue de 1 mL (26 G, 0,45 mm) (figure 1F). Insérez lentement l’aiguille de la seringue d’un microlitre dans le tissu cérébral à travers le trou jusqu’à ce qu’une certaine profondeur soit atteinte (z = -1,62 mm pour la plupart des souris P56) (Figure 1G).
   REMARQUE : Empiriquement, la profondeur d’insertion de -1,62 mm permet à la pointe de l’aiguille d’atteindre le milieu du corps calleux de la plupart des souris P56, de sorte que la lysolécithine peut être directement administrée dans le corps calleux pour induire la démyélinisation.
9. Injecter 1,5 μL de lysolécithine à 1 % à une vitesse de 0,3 μL/min. Après l’injection, attendez 5 minutes avant de retirer lentement la seringue d’un microlitre pour éviter les fuites de liquide le long du trajet de l’aiguille d’injection.
10. Coudre la peau avec des sutures chirurgicales 5-0 (Figure 1H).
11. Placez la souris sur un coussin chauffant pour éviter une baisse de la température corporelle. Administrer une injection sous-cutanée de 5 mg/kg de carprofène toutes les 24 heures pour soulager la douleur. Appliquez une pommade à l’érythromycine sur l’incision tous les jours pour vous assurer que la plaie cicatrise correctement. Placez la souris qui a subi une intervention chirurgicale dans une cage seule et nourrissez-la avec de la nourriture humide jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie. Surveillez la souris quotidiennement après l’opération.

2. Préparation de la pompe osmotique

REMARQUE : Les composants clés de la pompe sont illustrés à la figure 2A.

1. Déterminer la profondeur d’insertion de la canule de perfusion cérébrale dans le cerveau. Assurez-vous que l’aiguille de la canule de perfusion cérébrale utilisée mesure 3 mm de long et que chaque entretoise de réglage de la profondeur est de 0,5 mm. Pour obtenir une profondeur d’injection de 1,5 mm (près du calleux), fixez trois entretoises de réglage de la profondeur à l’aiguille de la canule de perfusion cérébrale à l’aide d’un adhésif tissulaire (figures 2B et C).
2. Pour remplir la pompe osmotique, fixez l’aiguille de la seringue fournie avec l’emballage de la pompe à une seringue de 1 mL et aspirez le médicament. Tenez la pompe à la verticale, insérez la seringue dans l’ouverture située en haut de la pompe et injectez lentement le médicament, en prenant soin de ne pas créer de bulles (voir la figure 2D). Lorsque le liquide s’écoule de l’ouverture, retirez lentement la seringue.
3. Retirez la bride blanche du régulateur de débit à l’aide de ciseaux ou de pinces, en faisant attention de ne pas plier ou écraser le modérateur de débit. Ensuite, insérez le modérateur de débit dans la pompe (Figure 2E). Pour déterminer s’il y a des bulles dans la pompe osmotique, pesez la pompe osmotique séparément avant et après le remplissage.
4. Coupez le cathéter à une certaine longueur en fonction de la taille de l’animal (cathéters de 20 à 25 mm pour les souris P56 qui pèsent environ 25 g). Fixez le cathéter à la canule de perfusion cérébrale.
5. Remplissez le cathéter de médicaments à l’aide de la seringue sans introduire d’air (Figure 2F).
6. Connectez le cathéter au modérateur de débit. Après la fixation, assurez-vous que le cathéter couvre environ 4 mm du modérateur de débit exposé (Figure 2G).
7. Pour s’assurer que la pompe osmotique peut fonctionner instantanément après l’implantation, immergez les pompes remplies dans une solution saline stérile à 0,9 % ou du PBS à 37 °C pendant au moins 4 à 6 h (de préférence jusqu’à une nuit) pour pré-mouiller la membrane semi-perméable à la surface de la pompe avec des solutions ayant la même pression osmotique que l’environnement tissulaire (Figure 2H).
8. Toutes les solutions chargées dans les pompes doivent être stériles. Les pompes ALZET sont fournies stériles, après avoir été exposées à une dose stérilisante de cobalt 60. Cependant, en cas de contamination extérieure, la surface de la pompe peut être nettoyée en l’essuyant avec de l’alcool isopropylique (70 % dans l’eau).

3. Implantation de la pompe osmotique

1. Attendre 3 jours après l’établissement du modèle de démyélinisation du corps calleux. Allumez le système d’anesthésie pour petits animaux. Désinfectez les ciseaux, les pinces à épiler et les pinces hémostatiques et trempez-les dans une solution d’alcool à 75 %. Posez des draps stériles dans la zone chirurgicale.
2. Anesthésie et sécurise à nouveau les souris sur l’appareil stéréotaxique. Couvrez la surface des globes oculaires avec une pommade pour les yeux pour éviter la sécheresse.
3. Désinfectez la plaie d’origine avec de l’alcool à 75 %. Ouvrez l’incision chirurgicale qui a été précédemment cousue (Figure 3A) et élargissez l’incision aux omoplates (Figure 3B).
4. Séparez la peau du tissu conjonctif sous-cutané à l’aide d’une pince hémostatique ou d’une pince à épiler au niveau de l’omoplate pour ouvrir une cavité (figure 3C). Placez la pompe osmotique dans la cavité (Figure 3D, E).
5. À l’aide d’un coton-tige, essuyez délicatement et exposez le trou d’épingle à la surface du crâne créé lors de l’établissement du modèle de démyélinisation (voir étape 1.8). Insérez la canule de perfusion cérébrale à travers ce trou d’épingle perpendiculairement et fixez-la rapidement sur le crâne avec un adhésif tissulaire (Figure 3F).
6. Retirez la languette amovible au-dessus de la canule de perfusion cérébrale à l’aide d’une paire de ciseaux (Figure 3G, H). Vous pouvez également retirer la languette avant d’insérer la canule pour éviter de trembler pendant ce processus.
7. Cousez l’incision ou fixez-la avec un adhésif tissulaire (Figure 3I).
8. Après l’opération, placez la souris sur un coussin chauffant pour éviter une chute de la température corporelle. Administrer une injection sous-cutanée de 5 mg/kg de carprofène toutes les 24 heures pour soulager la douleur. Appliquez une pommade à l’érythromycine sur l’incision tous les jours pour vous assurer que la plaie cicatrise correctement. Placez l’animal seul dans une cage et nourrissez-le avec de la nourriture humide jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli.

Résultats

Figure 1 : Mise en place du modèle murin de démyélinisation induite par la lysolécithine. (A) Fixez la souris dans l’appareil stéréotaxique. (B) Ouvrez une incision de 1 cm au milieu de la sagitte pour exposer l...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pompe à air d’anesthésie	RWD	R510-29	E05818-006
Kit de perfusion cérébrale 3	ALZET	8851	1-3 mm
Carprofène	Macklin	C830557-1g	5 mg/kg toutes les 24
h Oeil d’érythromycine pommade	Along technology	YCKJ-RJ-024780	Couvrir la surface des globes oculaires pendant l’anesthésie
Pommade à l’érythromycine	pythonbio	RG180
Appareil d’évacuation des gaz	RWD	R546W	E05518-002
L-α-lysophosphatidylcholine	Sigma	L0906	Dissoudre à 1 % avec une
seringue stérile PBS Microliter	Hamilton	65460-05 Série de	seringues :1700, 10 μL, calibre 33
Pompe micro-osmotique modèle 1002	ALZET	4317	0,25 μL par heure, 14 jours
PBS (pH = 7,3)	ORIGENE	ZLI-9061
Pentobarbital sodique	Shanghai Civi	CAS NO : 57-33-0	150-200 mg/kg injection intrapéritonéale pour euthanasie
Appareil d’anesthésie pour petits animaux	RWD	R520IE	E05807-006 M
Équipement stéréotaxique	RWD	E06382
Stérilisateur STERI 250	Keller	31101	Stérilisation rapide des instruments chirurgicaux
Sutures chirurgicales	Shanghai jinhuan	F504	5-0
Aiguille de seringue (1 mL)	Shanghai KDL	6930197811018	calibre 26 (0,45 mm x 16 mm)
Test de médicament et de solvant	Dépendant de l’expérience	N/A
Système de surveillance homéothermique Thermostar	RWD	69026	Maintenir la température corporelle pendant l’anesthésie
Adhésif tissulaire Vetbond	3M	1469SB	Fixer la canule de perfusion cérébrale et coller l’incision cutanée